रसायन विज्ञान

एसाइलेशन

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विशेषज्ञता का क्षेत्र - कार्बनिक रसायन विज्ञान

एसाइलेशन के दौरान, इलेक्ट्रोफिलिक एसाइल समूहों को एचओ, एचएस, एचएन या उपयुक्त एचसी समूहों वाले कार्बनिक यौगिकों में पेश किया जाता है। कार्बोक्जिलिक एसिड एस्टर और फ्राइडल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन का उत्पादन करने के लिए अल्कोहल और फिनोल का एसाइलेशन।


एसाइलेशन

अंतर्गत एसाइलेशन एक मौजूदा रासायनिक यौगिक में एक एसाइल समूह की शुरूआत को समझता है। कार्बोक्जिलिक एसिड एसिलेटिंग एजेंट के रूप में काम कर सकता है, लेकिन अधिक प्रतिक्रियाशील कार्बोक्जिलिक एसिड हलाइड्स का अक्सर उपयोग किया जाता है, जो सक्रियण के बाद एक इलेक्ट्रॉन-समृद्ध अणु के साथ प्रतिक्रिया करता है।

फ्राइडल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन सुगंधित प्रणालियों का एक महत्वपूर्ण एसाइलेशन है। यह एसाइल समूह बनाने के लिए लुईस एसिड के रूप में एल्यूमीनियम हैलाइड का उपयोग करता है।

फ्राइज़ पुनर्व्यवस्था सहित इंट्रामोल्युलर एसाइलेशन को भी जाना जाता है। यहां, एसाइल समूह को एक लुईस एसिड द्वारा फिनाइल एस्टर से अलग किया जाता है और फिर खुद को फिर से रिंग से जोड़ देता है।

अधिक व्यापक रूप से, एल्डिहाइड फ़ंक्शन (फॉर्माइलेशन) की शुरूआत को एसाइलेशन के एक विशेष मामले के रूप में देखा जा सकता है। फॉर्माइलेशन में हाइड्रोफॉर्माइलेशन, विल्समीयर फॉर्माइलेशन और गैटरमैन-कोच और रीमर-टीमैन प्रतिक्रियाएं शामिल हैं।

हालांकि, एसाइलेशन कार्बन-कार्बन बांड के गठन तक सीमित नहीं हैं। ऐल्कोहॉल से ऐमीन और एस्टर से एमाइड का निर्माण भी एसाइलेशन के रूप में संदर्भित किया जा सकता है, विशेष रूप से जैव रासायनिक संदर्भ में। जैविक प्रणालियों में, एसाइलेशन को ट्रांसएसिलेसेस द्वारा एंजाइमेटिक रूप से किया जा सकता है, जो ट्रांसफरेस का एक उपसमूह है। पेप्टाइड्स के निर्माण के लिए ट्रांसपेप्टिडेस भी इस संदर्भ में महत्वपूर्ण हैं।


विषयसूची

बेंजीन के साथ कार्बोक्जिलिक एसिड क्लोराइड की प्रतिक्रिया का उपयोग करके तंत्र को निम्नलिखित अनुभाग में समझाया गया है। फ्राइडल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन की शुरुआत इस तथ्य से होती है कि कार्बोक्जिलिक एसिड क्लोराइड के कार्बोनिल ऑक्सीजन पर लुईस एसिड 1 समन्वित और इस तरह कार्बोनिल कार्बन को और सकारात्मक बनाता है (2) हालांकि, लुईस एसिड भी क्लोरीन के साथ समन्वय कर सकता है और उसी प्रभाव को ट्रिगर कर सकता है (3) तब एक एसाइलियम केशन का उपयोग किया जा सकता है 4 उत्पन्न होता है, जो एक इलेक्ट्रोफिलिक सुगंधित प्रतिस्थापन में बेंजीन पर हमला करता है और सुगंधित चरित्र को बेअसर करता है। किस हद तक एसाइल हैलाइड लुईस एसिड का परिसर 2 या a (मेसोमेरिक स्थिर) [4] एसाइलियम धनायन 4 सक्रिय एजेंट सब्सट्रेट, एसाइल व्युत्पन्न और विलायक दोनों पर निर्भर करता है। एक प्रोटॉन के निकलने के बाद, प्रारंभिक अंतिम उत्पाद पुन: व्यवस्थित हो जाता है 7. लुईस एसिड अभी भी कार्बोनिल ऑक्सीजन से समन्वित है। हाइड्रोलिसिस को अंतिम चरण में एक सफाई कदम के रूप में देखा जाना चाहिए और कीटोन सेट करना चाहिए 8 नि: शुल्क। एक नियम के रूप में, अरोमैटिक्स स्वयं अधिक प्रतिक्रिया के लिए सॉल्वैंट्स के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि, नाइट्रोबेंजीन, नाइट्रोमीथेन या, कम तापमान पर, डाइक्लोरोमेथेन का भी उपयोग किया जाता है। [5] [6]

बेंजीन डेरिवेटिव संपादित करें

एसाइल हैलाइड-लुईस एसिड कॉम्प्लेक्स की अक्सर उच्च स्टेरिक आवश्यकताओं के कारण, फ्रीडेल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन में उच्च रेजियोसेलेक्टिविटी होती है, जो कि मोनोसबस्टिट्यूटेड बेंजीन डेरिवेटिव के कार्यान्वयन के मामले में है। पैराउत्पाद लीड। फ़्रीडेल-शिल्प के अनुसार प्रतिस्थापित अरोमैटिक्स को निष्क्रिय करना नहीं अम्लीकृत तदनुसार, इस प्रतिक्रिया में कई एसाइलेशन की उम्मीद नहीं की जाती है। ये गुण फ़्रीडेल शिल्प बनाते हैंएसाइलेशन फ्रीडेल-शिल्प की तुलना में कृत्रिम रूप से मूल्यवानalkylation.

वेरिएंट संपादित करें

प्रतिक्रिया का महत्व इस तथ्य से और भी अधिक हो जाता है कि पॉलीफॉस्फोरिक एसिड में कार्बोक्जिलिक एनहाइड्राइड और कार्बोक्जिलिक एसिड भी उपयुक्त एसाइलिंग एजेंट हैं। फ्रीडेल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन और वोल्फ-किशनर प्रतिक्रिया या क्लेमेन्सन रिडक्शन के अनुक्रम के परिणामस्वरूप, अल्काइल-प्रतिस्थापित एरोमेटिक्स भी कृत्रिम रूप से सुलभ हैं। गैटरमैन-कोच संश्लेषण प्रतिक्रिया का एक विशेष मामला है।

नए प्रकार [7] हैं जो हैलोजन युक्त लुईस एसिड या प्रोटिक एसिड का उपयोग एडक्ट्स के रूप में नहीं करते हैं और प्रतिक्रिया को विभिन्न ठोस पदार्थों के संपर्क में होने देते हैं। जिंक ऑक्साइड का उपयोग विशेष रूप से फायदेमंद साबित हुआ है। [8] क्लोरोबेंजीन जैसे सक्रिय और (कमजोर) निष्क्रिय दोनों तरह के सुगंधित पदार्थों के साथ, कई मामलों में हल्के प्रतिक्रिया स्थितियों (कमरे के तापमान) और कम प्रतिक्रिया समय (कुछ मिनट) के तहत उच्च रूपांतरण और पैदावार प्राप्त की जा सकती है। प्रतिक्रिया विलायक मुक्त की गई थी। जिंक ऑक्साइड, जिसे सबस्टोइकोमेट्रिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है, को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है। एक जलीय कार्य-अप आवश्यक नहीं था। अधिक शुद्धिकरण के बिना अधिकांश मामलों में उच्च उत्पाद शुद्धता प्राप्त करने के लिए एक साधारण गैर-प्रोटिक अर्क पर्याप्त था। तंत्र की जांच नहीं की गई है। यह बोधगम्य है कि जिंक क्लोराइड एक मध्यवर्ती के रूप में लुईस एसिड के रूप में बनता है, लेकिन प्रतिक्रिया धातु ऑक्साइड के बजाय ग्रेफाइट पर भी होती है। [9] क्लोराइड के बजाय कार्बोक्जिलिक एसिड एनहाइड्राइड के साथ, प्रतिक्रिया विफल हो गई। एल्यूमीनियम ऑक्साइड सहित कई अन्य धातु ऑक्साइड काफी कम या अनुपयोगी पाए गए। आयरन (III) ऑक्साइड और आयरन (III) सल्फेट के साथ अच्छे परिणाम प्राप्त हुए हैं। [10]

हेक्साफ्लोरोइसोप्रोपेनॉल में विलायक के रूप में, इलेक्ट्रॉन-समृद्ध एरोमेटिक्स की प्रतिक्रिया 25 डिग्री सेल्सियस पर आगे की एडिटिव्स की आवश्यकता के बिना होती है। [1 1]


विवरण एस्टरीफिकेशन और एसाइलेशन

अमीनो एसिड ज्यादातर zwitterions के रूप में होते हैं। कार्यात्मक समूहों को कार्यात्मककरण के लिए तैयार किया जाना चाहिए। अम्लीय श्रेणी में धनायन का परिणाम होता है; इसे कार्बोक्सिल समूह के स्थान पर एस्ट्रिफ़ाइड किया जा सकता है। आयन मूल श्रेणी में मौजूद होता है। अमीनो समूह को एसाइलेटेड किया जा सकता है। तटस्थ प्रतिक्रिया उत्पाद (एमाइन और कार्बोक्जिलिक एसिड) क्षार और एसिड की समान मात्रा को जोड़कर प्राप्त किए जाते हैं।

प्रतिलिपि एस्टरीफिकेशन और एसाइलेशन

शुभ दिन और स्वागत है! यह वीडियो अमीनो एसिड के एस्टरीफिकेशन और एसाइलेशन के बारे में है। आपको अमीनो एसिड, उनकी संरचना और एक ज़्विटेरियन क्या हैं, इसका पूर्व ज्ञान होना चाहिए। आपको अमीनो एसिड संरचना के तटस्थ रूप के बारे में सूचित किया जाना चाहिए। आपको पता होना चाहिए कि अमीनो एसिड कण का धनायन या ऋणायन क्या होता है। आपको पीएच मान और अनुमापन वक्र से भी परिचित होना चाहिए, इसके लिए एक वीडियो है। वीडियो का उद्देश्य आपको पीएच मान के आधार पर एस्टरीफिकेशन और एसाइलेशन के बीच संबंध के करीब लाना है। वीडियो को 4 खंडों में विभाजित किया गया है: 1. अमीनो एसिड अणु 2. एस्टरीफिकेशन 3. एसाइलेशन और 4. सारांश।

अमीनो एसिड अणु: अमीनो एसिड अणु को अक्सर तटस्थ रूप में दर्शाया जाता है। लेकिन हम पहले से ही जानते हैं कि ज्यादातर समय आप एक zwitterion के साथ काम कर रहे हैं। शर्तों के आधार पर, अमीनो एसिड अणु एक धनायन के रूप में या एक आयन के रूप में मौजूद हो सकता है। zwitterion पहले से ही एकत्रीकरण की ठोस अवस्था में मौजूद है, लेकिन 7 के pH मान पर जलीय घोल में भी, हम ज्यादातर zwitterions के साथ काम कर रहे हैं। हम मुख्य रूप से जलीय घोल में धनायनों का सामना करते हैं जब पीएच मान <7 होता है, अर्थात जब यह एक अम्लीय माध्यम होता है। मूल माध्यम में उच्च पीएच मान पर, अमीनो एसिड मुख्य रूप से आयनों के रूप में मौजूद होते हैं। यह कहा जा सकता है कि अमीनो एसिड का तटस्थ रूप वास्तविकता में शायद ही कभी पाया जाता है। आइए याद करें: अम्लीय क्षेत्र में हम मुख्य रूप से अमीनो एसिड अणु में एक मुक्त कार्यात्मक कार्बोक्सिल समूह के साथ काम कर रहे हैं, यानी समूह COOH के साथ, जो अणु के कार्बोक्जिलिक एसिड को बनाता है। दूसरी ओर, मूल श्रेणी में, मुक्त अमीनो समूह NH2 बनता है। तो पीएच को बदलकर हम मुख्य रूप से कार्बोक्सिल समूह या एमिनो समूह प्राप्त कर सकते हैं।

एस्टरीफिकेशन: अमीनो एसिड मुख्य रूप से ज्विटेरियन के रूप में मौजूद होता है। एस्टरीफिकेशन के लिए हमें उनके कार्बोक्सिल समूह को सक्रिय करना होगा। हम पीएच कम करते हैं, यानी हम एसिड जोड़ते हैं। परिणाम कटियन है। कार्बोक्सिल समूह को अब अल्कोहल के साथ एस्ट्रिफ़ाइड किया जा सकता है। मैंने मेथनॉल के साथ कार्यान्वयन को चुना। एस्टरीफिकेशन को सफलतापूर्वक आगे बढ़ाने के लिए एक एसिड की आवश्यकता होती है। संबंधित एस्टर बनता है। आइए मान लें कि हमने हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ उत्प्रेरित किया है, फिर एस्टर हाइड्रोक्लोराइड के रूप में बनता है। आधार के समतुल्य जोड़ के परिणामस्वरूप अंत में तटस्थ यौगिक होता है, एक अमीन जो एक एस्टर भी है। अंतिम प्रतिक्रिया चरण में, सोडियम क्लोराइड और पानी अलग हो जाते हैं। अब हम व्यक्तिगत प्रतिक्रिया भागीदारों का नाम देना चाहते हैं: (ए), (बी), (सी) और (डी)। (ए) एमिनो एसिड का zwitterion है। (बी) उनका कटियन है। (सी) हाइड्रोक्लोराइड है। और (डी) अमीन है। इस प्रकार, उपयुक्त परिस्थितियों में, हमने कार्बोक्सिल समूह को सफलतापूर्वक एस्ट्रिफ़ाइड किया है।

एसाइलेशन: एसाइलेशन के लिए हमें यह सुनिश्चित करना होगा कि मुक्त अमीनो समूह NH2 मौजूद है। तदनुसार, zwitterion हाइड्रॉक्साइड आयनों की एक समान मात्रा के साथ प्रतिक्रिया करता है - पानी निकलता है। परिणाम अमीनो एसिड अणु का आयन है। यह एक अमीन है। यह एक एसिड क्लोराइड के साथ प्रतिक्रिया करता है। इस प्रक्रिया में हाइड्रोजन क्लोराइड निकलता है। परिणामी आयन भी एक एमाइड है। हाइड्रोजन आयनों की एक समान मात्रा का योग एक तटस्थ यौगिक प्रदान करता है। अब हम व्यक्तिगत प्रतिक्रिया भागीदारों का नाम देना चाहते हैं: (ए), (बी), (सी) और (डी)। (ए) zwitterion है। (बी) अमीनो एसिड का आयन है। (सी) एक नमक है, जैसा कि हम जानते हैं, एक ही समय में एक एमाइड भी है। (डी) एक एसिड, एक कार्बोक्जिलिक एसिड है। प्रतिक्रिया के संचालन के संबंध में, यह भी स्पष्ट रूप से कहा जाना चाहिए कि पहले चरण में आधार की एक समान मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए। दूसरे चरण में बनने वाले हाइड्रोजन क्लोराइड को हटा देना चाहिए। इसके लिए एक प्रोटॉन ट्रैप का उपयोग किया जाता है, जो एक सहायक आधार है - आमतौर पर एक अमीन।

सारांश: अमीनो एसिड कण मुख्य रूप से समाधान में zwitterions के रूप में पाए जाते हैं। क्रियात्मक समूहों को या तो अम्ल या क्षार जोड़कर सक्रिय किया जा सकता है। इसका मतलब है कि कोई या तो पीएच रेंज <7 में या पीएच रेंज> 7 में काम करता है। पहले मामले में मुख्य रूप से अमीनो एसिड के धनायन बनते हैं, जबकि दूसरे मामले में आयन बनते हैं। धनायनों में मुक्त कार्बोक्सिल समूह होते हैं और इसलिए उन्हें अल्कोहल के साथ एस्ट्रिफ़ाइड किया जा सकता है। आयनों में मुक्त अमीनो समूह होते हैं और इसलिए इसे एसाइलेटेड किया जा सकता है। क्षारक या अम्ल की समतुल्य मात्रा का योग उदासीन यौगिक प्रदान करता है। पहले मामले में हमें एक यौगिक मिलता है जिसमें एक एमिनो समूह होता है। दूसरे मामले में हमारे पास एक यौगिक है जो एक कार्बोक्जिलिक एसिड है। पहली स्थिति में हमें एक ऐमीन प्राप्त होती है। दूसरे मामले में एक कार्बोक्जिलिक एसिड।


फ्रीडल क्राफ्ट्स एसाइलेशन को सरल शब्दों में समझाया गया है

में फ़्रीडल शिल्प एसाइलेशन क्या यह नाम प्रतिक्रिया में कार्बनिक रसायन विज्ञानरसायनज्ञ चार्ल्स फ्रिडेल और जेम्स मेसन क्राफ्ट्स के नाम पर। इन दोनों के पास भी है फ़्रीडल शिल्प alkylation खोजा गया है, यही कारण है कि नाम बहुत समान हैं।

आपने ऐसा करने दिया सुगंधित, एक मजबूत . का उपयोग करना लेविस अम्ल जैसा उत्प्रेरक, के साथ एसिड एनहाइड्राइड या कार्बोक्जिलिक एसिड हैलाइड प्रतिक्रिया. यह बन जाता है हाइड्रोजन परमाणु एक प्रतिक्रियाशील सुगंधित पर एक एसाइल अवशेष एवजी और एक कीटोन उत्पन्न होता है।


सी।5-सदस्यीय एन-हेटरोसायकल का एसाइलेशन, II 1-एसीलिमिडाजोल, थियाजोल और ऑक्साजोल का एसाइलेशन और तैयारी एन- अप्रतिस्थापित सी।-एसिलाज़ोल

प्रोफेसर डॉ. रिचर्ड वेग्लर 70वें जन्मदिन को समर्पित।

बायर एजी की अनुसंधान प्रयोगशालाएं, एल्बरफेल्ड प्लांट, पोस्टफैच 130105, डी-5600 वुपर्टल 1

प्रोफेसर डॉ. रिचर्ड वेग्लर 70वें जन्मदिन को समर्पित।

सार

इमिडाज़ोल (1ट्राइएथिलामाइन की उपस्थिति में एसिड क्लोराइड के साथ प्रतिक्रिया करके ट्राईसिलीमिडाज़ोलिनिलिमिडाज़ोल बनाता है 5. इसी तरह, बेंज़िमिडाज़ोल से (7) ट्राईसिल यौगिक 8. - 2-एसीलिमिडाजोल 1-स्थिति में अप्रतिस्थापित 4 तथा सी।-एसाइल-1,2,4-ट्रायज़ोल्स 13 1-मेथोक्सिमिथाइल यौगिकों के एसाइलेशन द्वारा प्राप्त किए जाते हैं 10 और बाद में मेथोक्सिमिथाइल सुरक्षात्मक समूह का विभाजन। - अन्य एज़ोल्स जैसे बेंज़ोक्साज़ोल (14बी), बेंज़ोथियाज़ोल (14सी) और 2-फिनाइल-1,3,4-ऑक्साडियाज़ोल (14डी) एसिड क्लोराइड के साथ फार्म सी।-एसिलाज़ोल 15 और कार्बोक्जिलिक एसिड डायज़ोलिल मिथाइल एस्टर 16.

सार

सी।5-सदस्यीय N-Heterocycles, II का Acylation - 1-Acylimidazoles, Thiazoles और Oxazoles का Acylation, और की तैयारी एन-अप्रतिस्थापित सी।-एसिलाज़ोल्स

इमिडाज़ोल्स (1ट्राइएथिलामाइन की उपस्थिति में एसाइल क्लोराइड के साथ प्रतिक्रिया करके ट्राईसिलीमिडाज़ोलिनिलिमिडाज़ोल बनाता है 5. ट्राईसिल यौगिकों के अनुरूप 8 बेंज़िमिडाज़ोल से प्राप्त होते हैं (7) - 2-एसीलिमिडाजोल 4 अन्य सी।-एसिल-1,2,4-ट्रायज़ोल्स 13 स्थिति 1 में अप्रतिस्थापित 1-मेथोक्सिमिथाइल यौगिकों के एसाइलेशन द्वारा बनते हैं 10 इसके बाद मेथोक्सिमिथाइल प्रोटेक्टिंग ग्रुप को हटा दिया गया। - अन्य एज़ोल्स, जैसे बेंज़ोक्साज़ोल (14बी), बेंज़ोथियाज़ोल (14सी) और 2-फिनाइल-1,3,4-ऑक्साडियाज़ोल (14डी) देने के लिए एसाइल क्लोराइड के साथ प्रतिक्रिया करता है सी।-एसिलाज़ोल्स 15 और डायज़ोलिलमेथाइल कार्बोक्सिलेट्स 16.


फ्रीडेल-शिल्प एसाइलेशन

यह प्रतिक्रिया लुईस एसिड की उपस्थिति में एसिड एनहाइड्राइड या एसिड क्लोराइड को इलेक्ट्रॉन-समृद्ध एरोमेटिक्स के साथ प्रतिक्रिया करके एरोमैटिक्स के एसाइलेशन को सक्षम करती है।

फ्रीडेल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन एक इलेक्ट्रोफिलिक एरोमैटिक प्रतिस्थापन है जो इलेक्ट्रॉन-गरीब एरोमैटिक्स (जैसे नाइट्रो यौगिक, पाइरिडीन) के साथ नहीं होता है।

लुईस एसिड जैसे AlCl का उपयोग "उत्प्रेरक" के रूप में किया जाता है3, बीएफ3. चूंकि ये मध्यस्थ उत्पाद द्वारा जटिल होते हैं, लुईस एसिड अक्सर अधिक स्टोइकोमेट्रिक मात्रा में आवश्यक होते हैं। यदि एसिड एनहाइड्राइड का उपयोग किया जाता है, तो उत्प्रेरक के दो से अधिक समकक्षों का उपयोग करना पड़ता है, क्योंकि बनने वाला एसिड भी उत्प्रेरक को निष्क्रिय कर देता है।

उत्प्रेरक की क्रिया के कारण अभिकारक संगत एसाइलियम आयन के साथ संतुलन में है:

एसाइलियम आयन, जो केवल कम मात्रा में होता है, एक अच्छा इलेक्ट्रोफाइल है और एक इलेक्ट्रॉन-समृद्ध सुगंधित के साथ जल्दी से प्रतिक्रिया करता है:

वांछित उत्पाद एक जलीय कार्य-अप में जारी किया जाता है।

फ़्रीडेल-क्राफ्ट्स एल्केलाइज़ेशन की तुलना में फ़्रीडेल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन का एक प्रमुख लाभ यह है कि उत्पाद निष्क्रिय हो जाता है, और इसलिए दोहरे प्रतिस्थापन से इंकार किया जा सकता है।

एल्काइल-प्रतिस्थापित उत्पादों को क्लेमेन्सन या वोल्फ-किशनर द्वारा फ्राइडल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन से उत्पाद की कमी से प्राप्त किया जा सकता है:

औद्योगिक प्रक्रियाओं में, लुईस एसिड का उपयोग अब एसाइलेशन के लिए नहीं किया जाता है, क्योंकि जलीय कार्य के बाद बड़ी मात्रा में हाइड्रॉक्साइड कीचड़ का उत्पादन होता है, जिसका निपटान किया जाना चाहिए। एक विकल्प के रूप में, प्रोटोनिक एसिड के साथ प्रतिक्रियाएं उपलब्ध हैं, लेकिन इन्हें उच्च तापमान पर किया जाना चाहिए।

फ्रीडेल-क्राफ्ट्स एसाइलेशन का अभिविन्यास इलेक्ट्रोफिलिक, सुगंधित प्रतिस्थापन के नियमों का पालन करता है, ताकि में पैरा- या ऑर्थोस्थिति एक इलेक्ट्रॉन-दान करने वाले प्रतिस्थापन के लिए acylated है।


फील्ड बीन लेग्यूमिन का एसाइलेशन और भौतिक रासायनिक लक्षण वर्णन

1 फील्ड बीन लेग्यूमिन का एसाइलेशन और भौतिक रासायनिक लक्षण वर्णन। बर्लिन के तकनीकी विश्वविद्यालय के संकाय 15 द्वारा अनुमोदित शोध प्रबंध - खाद्य विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी - डॉक्टर ऑफ नेचुरल साइंसेज (डॉ। rer.nat।) की अकादमिक डिग्री प्राप्त करने के लिए फूड केमिस्ट कॉन्स्टेन्ज़ द्वारा प्रस्तुत किया गया। नोपफे समीक्षक: प्रो. डॉ. हबिल हर्बर्ट कुंजेक समीक्षक: प्रो. डॉ. हबिल क्लाउस डाइटर श्वेनके समीक्षक: प्रिवी.-डोज़। डॉ। J & oumlrg-Thomas M & oumlrsel वैज्ञानिक चर्चा का दिन: जून 14, 2 बर्लिन 2 डी 83

2 आभार वर्तमान शोध प्रबंध एक विषय पर प्रो. डॉ. केडी श्वेनके ने तीन साल के शोध में (जनवरी 1995 से दिसंबर 1996 और नवंबर 1997 से अक्टूबर 1998) और डीएफजी परियोजनाओं श्व 462 / 4-1 और श्व 462 / 4-2 पर आधारित है। जब तक अन्यथा उल्लेख नहीं किया जाता है, तब तक इंस्टीट्यूट फॉर एप्लाइड प्रोटीन केमिस्ट्री e.v., क्लेनमाचनो में प्लांट प्रोटीन केमिस्ट्री रिसर्च ग्रुप में काम किया गया था। मेरा विशेष धन्यवाद प्रो डॉ. विषय प्रदान करने, कई रचनात्मक चर्चाओं और मैत्रीपूर्ण समर्थन के लिए केडी श्वेनके। प्लांट प्रोटीन केमिस्ट्री वर्किंग ग्रुप के सभी कर्मचारी, विशेष रूप से डॉ। स्टेफी डुडेक, डॉ. राल्फ मोथेस, डॉ. मैं पीटर क्रॉस, सुश्री एंजेलिका क्रेजेवस्की, सुश्री हेल्गा बेयर और सुश्री बेट्टीना जंकर को उनके सहायक समर्थन, उत्तेजक चर्चाओं और सबसे ऊपर, सुखद प्रयोगशाला वातावरण के लिए धन्यवाद देता हूं। मैं सभी राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय सहयोग भागीदारों को उनके मैत्रीपूर्ण समर्थन और सफल सहयोग के लिए धन्यवाद देता हूं, विशेष रूप से डॉ. डीएससी मापन के समर्थन के लिए रूसी विज्ञान अकादमी, मॉस्को के जैव रासायनिक भौतिकी संस्थान में लारिसा मिखेवा। कई घनत्व और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन मापों को सक्षम करने के लिए एप्लाइड पॉलिमर रिसर्च, टेल्टो-सीहोफ के लिए फ्रौनहोफर इंस्टीट्यूट में एकहार्ड जी एंड ऑउम्लर्नित्ज़। डिट्रिच ज़िरवर और डॉ। मैक्स-डेलब्रुमल्क-सेंट्रम, बर्लिन-बुच में क्लॉस गैस्ट, सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी से परिचित होने के लिए डॉ। मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट फॉर कोलाइड एंड बाउंड्री सर्फेस रिसर्च, टेल्टो-सीहोफ में हर्बर्ट डौट्ज़ेनबर्ग, प्रकाश प्रकीर्णन के लिए माप के संयुक्त कार्यान्वयन के लिए

3 सामग्री 1 सामग्री की तालिका 1 सैद्धांतिक सिद्धांतों का परिचय और उद्देश्य वनस्पति भंडारण प्रोटीन वनस्पति भंडारण प्रोटीन की संरचना एस-ग्लोबुलिन ब्रॉड बीन और इसके मुख्य भंडारण प्रोटीन (लेग्यूमिन) प्रोटीन संशोधन अमीनो समूहों का रासायनिक संशोधन एमिडीन लेगिडाइन का एसाइलेशन एसिटिलेशन संशोधन और ब्रॉड बीन लेगिडिन का क्षारीकरण ऑमिनस बीन लेगिडिफिकेशन का रासायनिक सक्सेनाइलेशन कार्बोक्सिल समूहों का सक्सेनाइलेशन एस्टरीफिकेशन एमिडेशन डाइसल्फ़ाइड या सल्फ़हाइड्रील समूहों का ऑक्सीकरण हाइड्रोलिसिस और डीमिडेशन ग्लाइकोसिलेशन फॉस्फोराइलेशन सामग्री और तरीके प्रोटीन की तैयारी क्षेत्र बीन लेग्यूमिन के अलगाव के लिए प्रक्रिया लेग्यूमिन के नमूनों की एसिटिलेशन सक्सेनाइलेशन परीक्षण सामग्री की विशेषता - बायोरेट प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण संशोधन की डिग्री निर्धारित करने के लिए KJELDAHL विधियों के अनुसार प्रोटीन सामग्री। एन-एसिलेशन का निर्धारण डिग्री O-acylation की डिग्री का निर्धारण आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (SE-HPLC) जेल वैद्युतकणसंचलन जेल वैद्युतकणसंचलन (SDS-PAGE) नेटिव जेल वैद्युतकणसंचलन (BN-PAGE) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF MS) हाइड्रोफोबिसिटी की जांच के लिए तरीके . 28

4 सामग्री फ्लोरेसेंस जांच तकनीक रिवर्स फेज हॉक्लीस्टुंग्सफ्ल और यूमल्स सिगक्रोमैटोग्राफी (आरपी-एचपीएलसी) पॉलिमर में वितरण दो-चरण सिस्टम विधियों के लिए स्टिकर और ऑमलरंग ऑफ कंफर्मेशनल एंड ऑउम्लैंडरंगन हाइड्रोडायनामिक तरीके केशिका पीआर और ऑमलजिशन्सडिचटेमेसंग एनालिटिकल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन डायनेमिक यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी फ्लोरोस्कोपिक उत्सर्जन। स्पेक्ट्रोस्कोपी, सर्कुलर डाइक्रोइज्म स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों का अध्ययन करने के लिए कॉन्फॉर्मेशन स्टैबिलिटी और ऑमल्ट डिफरेंशियल स्कैनिंग कैलोरीमेट्री का अध्ययन करने के लिए थर्मोस्टेबिलिटी और ऑमल्ट फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी का अध्ययन करने के लिए विकृतीकरण की स्थिरता की जांच के परिणाम लेग्यूमिन के कार्यात्मक समूहों के एसाइलेशन एसाइलेटेड लेग्यूमिन नमूनों की संरचना पर जांच परिणाम के रूप में हाइड्रोफोबिसिटी में परिवर्तन एसाइलेशन का सतही हाइड्रोफोबिसिटी एसाइलेटेड लेग्यूमिन सैंपल की रिवर्स फेज-हाई परफॉर्मेंस लेग्यूमिनस सैंपल एसाइलेटेड लेग्यूमिनस सैंपल का वितरण एक बहुलक दो-चरण प्रणाली में एसाइलेटेड लेग्यूमिनस नमूनों का पृथक्करण और जुड़ाव एसाइलेटेड लेग्यूमिनस नमूनों का पृथक्करण और जुड़ाव एसाइलेटेड लेग्यूमिनस नमूनों का बड़े पैमाने पर क्रोमैटोग्राफी एसाइलेटेड लेग्यूमिनस नमूनों का विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन एसाइलेटेड लेग्यूमिनस नमूनों का नेटिव जेल वैद्युतकणसंचलन एसाइलेटेड लेग्यूमिनस नमूनों का अलगाव और लक्षण वर्णन उच्च दक्षता, वॉल्यूमेट्रिक-विशिष्ट एसिटिलेटेड लेग्यूमिनस सेडिमेंट्स के अत्यधिक एसिटिलेटेड लेग्यूमिनस लेग्यूमिनस सेडिमेंटेशन के अत्यधिक एसिटिलेटेड लेग्यूमिनस सेमेन्टेशन के अत्यधिक एसिटिलेटेड लेग्यूमिनस सैंपल और अत्यधिक सक्सेनिलेटेड लेग्यूमिन के वॉल्यूमेट्रिक-स्पेसिफिक डिफ्यूज्ड लेग्यूमिनस सैंपल यूवीएसिलेटेड लेग्यूमिन स्पेक्ट्रोस्कोपिक जांच एसाइलेटेड लेग्यूमिन नमूनों की स्पेक्ट्रोस्कोपी एसाइलेटेड लेग्यूमिन नमूनों की सर्कुलर डाइक्रोइक स्पेक्ट्रोमेट्री थर्मल स्थिरता और ऑम्ल्ट एसाइलेटेड लेग्यूमिनस सैंपल डेनाट्यूरेंट स्टेबिलिटी और ऑम्ल्ट एसाइलेटेड लेग्यूमिनस सैंपल चर्चा सारांश साहित्यिक सारांश। 13 वीं

5 संक्षिप्ताक्षरों की सूची 3 संक्षिप्ताक्षरों की सूची ac AKF ANS के रूप में AUZ BN-Page CD CPS DLS DTE GuHCl I ID IP Chap। MALDI-TOF MS MRW MWG PB Phe Pkt. Prot. RF RP-HPLC RSA RT SDS-PAGE SE-HPLC suc Trp Tyr var। VF (.% N-) एसिटिलेटेड (समय) ऑटोसहसंबंध फ़ंक्शन 8-एनिलिनो-1-नेफ्थलीन सल्फेट एमिनो एसिड एनालिटिकल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन ब्लू नेटिव पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन सर्कुलर डाइक्रोइज्म कॉम्प्लेक्स बफर के साथ, 5 एम NaCl डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग डाइथियोएरिथ्रिटोल गनीडिनियम हाइड्रोक्लोराइड आयनिक ताकत एचपीएलसी कॉलम के व्यास के अंदर आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट चैप्टर मैट्रिक्स-समर्थित मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन-टाइम-ऑफ-फ्लाइट-फॉस्फोरेसेंस- आणविक-आयनीकरण-प्रतिदीप्ति-बफर desorption आणविक आयनीकरण-प्रतिदीप्ति-बफर रिवर्स-चरण उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, कमरे का तापमान, सोडियम डोडेसिल सल्फेट की उपस्थिति में पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन प्रोटीन अमीनो समूहों को खोलना ओ-ब्लॉकिंग, ओ-एसिलेशन = प्रोटीन हाइड्रॉक्सिल समूहों का संशोधन

6 परिचय और उद्देश्य 4 1 परिचय और उद्देश्य ब्रॉड बीन (विसिया फैबा एल.), एक 11 एस-ग्लोब्युलिन (लेग्यूमिन) के देशी और एसाइलेटेड मुख्य भंडारण प्रोटीन पर रासायनिक संशोधन और भौतिक रासायनिक जांच पर वर्तमान कार्य रिपोर्ट। फील्ड बीन फलियों के अंतर्गत आता है। यूरोप में मकई की फलियां कृषि योग्य भूमि के लगभग 3% पर, दूसरी ओर अफ्रीका में 8%, एशिया में 9% कृषि योग्य भूमि पर उगाई जाती हैं [1]। यूरोप में खपत होने वाले प्रोटीन का केवल 3% यूरोपीय संघ में उत्पादित होता है और केवल 5% यूरोपीय संघ में उत्पादित फलियों से आता है [2]। फलियाँ मुख्य रूप से चीन से यूरोप में आयात की जाती हैं [3]। अनाज फलियां मानव और पशु पोषण के लिए प्रोटीन का एक मान्यता प्राप्त स्रोत हैं। उनमें कई ऐसे कारक भी होते हैं जो पोषण के लिए हानिकारक होते हैं (प्रोटीज अवरोधक, लेक्टिन, संघनित टैनिन, विसिन), जिन्हें विभिन्न प्रकार के उपचार विधियों का उपयोग करके निष्क्रिय या हटाया जा सकता है [3]। 1996 में यूरोपीय देशों में प्रति वर्ष औसतन 2.5 किलो शंख और निवासी (ब्राजील 16 किलो) की खपत की गई [4] और टी फील्ड बीन्स को चारे के रूप में उत्पादित किया गया [5]। जर्मनी में 1997 में 81 हेक्टेयर भूमि पर 236 टन शंख का उत्पादन किया गया था, 91% जानवरों के चारे के रूप में इस्तेमाल किया गया था, केवल 4% भोजन के रूप में [6]। सामान्य रूप से प्रोटीन को जो अधिक ध्यान दिया गया है वह कई खाद्य पदार्थों के एक घटक के रूप में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका से संबंधित है। उनके कार्यात्मक गुण और उनके लक्षित प्रभाव उन्हें खाद्य प्रणालियों में जैल, फोम और इमल्शन बनाने और स्थिर करने में सक्षम बनाते हैं [7]। उनके पोषण संबंधी शारीरिक महत्व के अलावा, वनस्पति प्रोटीन का एक कार्यात्मक महत्व भी है। प्रोटीन, स्टार्च, कच्चे रेशों जैसे पौधों या बीजों के हिस्सों से पृथक घटकों के भौतिक-रासायनिक और कार्यात्मक गुण, न केवल पोषण के क्षेत्र में बल्कि तकनीकी क्षेत्र (गैर-खाद्य उपयोग) में बढ़ते आवेदन के लिए बोलते हैं। . इसका एक मुख्य कारण उप-उत्पाद के रूप में भारी मात्रा में प्रोटीन का संचय है, उदा। बी स्टार्च में (आलू स्टार्च उत्पादन में अपशिष्ट जल में) और तेल उत्पादन (तिल बीज के दबाए और निष्कर्षण अवशेषों में)। उपयोगी और महत्वपूर्ण औद्योगिक उत्पादों के लिए अक्षय और जैव निम्नीकरणीय कच्चे माल के रूप में वनस्पति भंडारण प्रोटीन के लिए नई प्रौद्योगिकियों का तेजी से विकास, विशेष रूप से गैर-खाद्य क्षेत्र में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ, पहले से ही पूर्वाभास किया जा सकता है [6]।

7 परिचय और उद्देश्य 5 बीज प्रोटीन या प्रोटीन सामान्य रूप से, मूल अवस्था में, हालांकि, केवल शायद ही कभी कार्यात्मक गुणों का इष्टतम होता है। ये z हो सकते हैं। B. रासायनिक संशोधन द्वारा प्रभाव। ऐसा करने पर, प्रतिक्रियाशील पक्ष समूहों और प्रोटीन की स्थानिक संरचना को बदला जा सकता है [68]। रासायनिक संशोधन की विभिन्न संभावनाओं से लेकर वर्तमान कार्य में बीन लेग्यूमिन के क्षेत्र में एसाइलेशन (एसिटिलेशन और सक्सेनाइलेशन) के कारण होने वाले परिवर्तनों की जांच का वर्णन किया गया है। साहित्य में पशु प्रोटीन (जैसे कैसिइन [8, 9], गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन [1]) के एसाइलेशन और 11 एस-ग्लोबुलिन युक्त प्रोटीन आइसोलेट्स, कॉन्संट्रेट या प्रोटीन आइसोलेट्स के एसाइलेशन से संबंधित अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला है। विभिन्न तेल पौधों और फलियों के अंश (जैसे सोयाबीन / ग्लाइसिनिन [11, 12], रेप / क्रूसिफेरिन [13, 14, 15], सूरजमुखी / हेलियनटिनिन [15, 16, 141], मूंगफली / अरचिन [17, 18]) सौदा। प्रो. के.डी. श्वेनके के कार्यकारी समूह में, एसाइलेटेड फील्ड बीन प्रोटीन आइसोलेट्स पर व्यापक जांच की गई, जिसमें लगभग 65% लेग्यूमिन [19, 2, 21] शामिल हैं। फील्ड बीन प्रोटीन आइसोलेट्स के रासायनिक और कार्यात्मक गुणों की जानकारी और उनके संशोधनों को SCHMANDKE [44] द्वारा संक्षेपित किया गया है। प्रोटीन की कार्यक्षमता में लक्षित परिवर्तन के लिए संरचना और कार्यक्षमता के बीच संबंधों को स्पष्ट करना आवश्यक है। हालांकि, रासायनिक संशोधन के दौरान व्यवहार और एसाइलेशन के प्रभाव को आसानी से प्रोटीन आइसोलेट से शुद्ध फील्ड बीन लेग्यूमिन में स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है, जो कि फील्ड बीन प्रोटीन सॉलेट [22] के एसिटिलीकरण के बाद परिणामों की तुलना का परिणाम है। शुद्ध क्षेत्र बीन लेग्यूमिन [75] इंटरफ़ेस गुण स्पष्ट हो जाते हैं। केवल शुद्ध 11 एस-ग्लोब्युलिन की जांच उनके संरचनात्मक परिवर्तनों के बारे में परिभाषित जानकारी देती है, क्योंकि अक्सर जांच की गई प्रोटीन प्रचुर मात्रा में मामूली घटकों को अलग करती है और विभिन्न मिश्रण हस्तक्षेप करते हैं। एसिटिलेटेड प्रोटीन आइसोलेट्स और कुछ एसिटिलेटेड फील्ड बीन लेग्यूमिन डेरिवेटिव्स की संरचना और इंटरफेस व्यवहार के बीच संबंधों की जांच KRAUSE [23, 75] द्वारा की गई थी। वर्तमान कार्य के दायरे में मूल कार्य बीन (फलियां) के मुख्य भंडारण प्रोटीन को यथासंभव शुद्ध रूप से अलग करना और रासायनिक रूप से संशोधित तैयारी का उत्पादन करना था। अलग-अलग देशी लेग्यूमिन से विभिन्न डिग्री के संशोधन के साथ एसिटिलेटेड और सक्सेनिलेटेड नमूने तैयार किए गए थे।

8 परिचय और उद्देश्य 6 इन डेरिवेटिव्स को तब रासायनिक रूप से चित्रित किया गया था, और उनके भौतिक-रासायनिक गुणों पर व्यापक अध्ययन किए गए थे जो पिछली जांच से परे थे। अलग-अलग एसाइलेटेड लेग्यूमिन डेरिवेटिव के भौतिक-रासायनिक गुणों की तुलना देशी लेग्यूमिन से की गई थी। इस थीसिस का एक अन्य उद्देश्य प्रकार (एसिटिलेशन, सक्सेनाइलेशन) और कार्यात्मक समूहों के संशोधन की डिग्री के आधार पर लेग्यूमिन में होने वाले संरचनात्मक या गठनात्मक परिवर्तनों को स्पष्ट करना था। लेग्यूमिन के कार्यात्मक गुणों के हेरफेर के संबंध में, संरचना स्थिरता और सतह हाइड्रोफोबिसिटी की जांच का विशेष महत्व था। कार्यात्मक गुणों और प्रोटीन संरचना के बीच संबंधों के ज्ञान के अलावा, रासायनिक संशोधन के माध्यम से औद्योगिक अनुप्रयोग के अनुरूप प्रोटीन के उत्पादन के लिए भी तकनीकी रूप से प्रासंगिक कारकों जैसे पीएच मान, आयनिक शक्ति और प्रोटीन पर तापमान के प्रभाव के ज्ञान की आवश्यकता होती है। संरचना। इस कारण से, चयनित नमूनों की संरचना और भौतिक-रासायनिक गुणों पर विलायक की आयनिक शक्ति के प्रभाव के प्रश्न की जांच की गई। वर्तमान कार्य के विवरण क्रोमैटोग्राफिक, इलेक्ट्रोफोरेटिक, हाइड्रोडायनामिक (केशिका विस्कोमेट्री, सटीक घनत्व माप, विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग), स्पेक्ट्रोस्कोपिक (प्रतिदीप्ति, यूवी, सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी) और थर्मोडायनामिक (हीटिंग द्वारा खुलासा) की मदद से किए गए थे। Denaturans की उपस्थिति) जांच के तरीके मिले।

9 सैद्धांतिक मूल बातें 7 2 सैद्धांतिक मूल बातें 2.1 पादप भंडारण प्रोटीन प्रोटीन का कोई समान व्यवस्थित वर्गीकरण नहीं है। आमतौर पर उपयोग किया जाता है या तो उनके जैविक कार्य के अनुसार वर्गीकरण होता है, उदा। बी भंडारण प्रोटीन में, परिवहन प्रोटीन, संरचनात्मक प्रोटीन, एंजाइम या पौधे और पशु प्रोटीन या मांसपेशी प्रोटीन, प्लाज्मा प्रोटीन, दूध प्रोटीन आदि में उनकी घटना के अनुसार। प्रोटीन को अक्सर उनकी संरचना के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है। फिर गोलाकार और तंतुमय प्रोटीन के बीच अंतर किया जाता है। वनस्पति प्रोटीन का वर्गीकरण 1924 में OSBORNE [24] द्वारा शुरू किया गया था। ओसबोर्न योजना वनस्पति प्रोटीन को उनकी घुलनशीलता के अनुसार या तो पानी (एल्ब्यूमिन), नमक के घोल (ग्लोबुलिन), जलीय अल्कोहल (प्रोलामिन) में या अम्लीय या क्षारीय घोल (ग्लूटलाइन) में अलग करती है। बीज भंडारण प्रोटीन अंकुरण के लिए नाइट्रोजन आपूर्तिकर्ता के रूप में कार्य करते हैं। सिद्धांत रूप में, सभी प्रोटीन, जहां तक ​​वे अंकुरण के दौरान टूट जाते हैं और अंकुर की आपूर्ति के लिए काम करते हैं, उन्हें आरक्षित या भंडारण प्रोटीन के रूप में संदर्भित किया जा सकता है। डर्बीशायर एट अल के अनुसार। [25] पके बीजों से निकाले गए प्रत्येक प्रोटीन को एक संभावित भंडारण प्रोटीन के रूप में माना जाना चाहिए, यदि कुल प्रोटीन का उसका हिस्सा 5% से अधिक है। Im allgemeinen wird die Bezeichnung Speicherprotein auf die in den Aleuronkörnern der Speichergewebe vorkommenden Globuline angewendet, allerdings unter dem Vorbehalt, daß eine enzymatische Funktion dieser Proteine nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden kann [47] Struktur pflanzlicher Speicherproteine Die typischen Speicherproteine der Cerealien sind Prolamine und Gluteline, die Samen von Leguminosen enthalten überwiegend Globuline und Albumine. Unter den Samenalbuminen kommen auch zwei Gruppen wasserlöslicher Proteine mit besonderen biologischen Aktivitäten vor: Proteinaseinhibitoren, welche die Aktivität proteolytischer Enzyme hemmen (z. B. Trypsin- und Chymotrypsininhibitoren) und Phytohämagglutinine, die Erythrozyten agglutinieren können (z. B. Lectine). Die meisten Speicherproteine weisen nur wenig Cystein und Methionin auf, wodurch ihre biologische Wertigkeit limitiert wird [31].

10 Theoretische Grundlagen 8 Bei den anteilig überwiegenden, in den Aleuronkörnern der Kotyledonen lokalisierten Globulinen werden zwei Hauptfraktionen unterschieden: die vicilinartigen Globuline mit Sedimentationskoeffizienten von ungefähr 7 S (z. B. Vicilin in Ackerbohne und Erbse, &beta- Conglutin in Lupine, Phaseolin in Buschbohnen) und die leguminartigen Globuline mit Sedimentationskoeffizienten von ungefähr S [25] (z. B. Legumin in Ackerbohne, Glycinin in Soja, Arachin in Erdnüssen, &alpha-conglutin in Lupine, Cruciferin in Raps). Die Trennung von Leguminen und Vicilinen kann durch die Ausnutzung der verschiedenen isoelektrischen Punkte erfolgen (IP Leg = 4,7 und IP Vic = 5,5). Neben den 11 S - und den 7 S -Globulinen sind niedermolekulare 2 S-Globuline sind nachweisbar, die im Fall von Raps (Napin) sogar das Hauptspeicherprotein darstellen. Globuläre Proteine bestehen aus Polypeptidketten, die sich nach oder während der Synthese, entsprechend dem energetisch günstigsten Zustand, spontan zu ihrer Raumstruktur falten. Ihre Raumstruktur ist bereits durch die Sequenz der Aminosäuren festgelegt. Sie sind typischerweise recht kompakt, annähernd kugelig und enthalten hydrophobe, sehr dicht gepackte Kerne vorrangig unpolarer Aminosäurereste [26]. Dagegen befinden sich die polaren hydrophilen Aminosäurereste überwiegend an der Oberfläche des Proteinmoleküls [26, 27]. Globuläre Proteine haben ein spezifisches Volumen von ungefähr, cm 3 /g. Ihr Radius kann annähernd durch die Gleichung R = 6, [M r ] 1/3 bestimmt werden [27], und ihre Dichte beträgt ungefähr 1, g/cm 3 [28]. Vor allem große globuläre Proteine (> 15 Aminosäuren) sind oft in kleineren strukturierten Domänen organisiert [26, 27]. Komplexe Proteine bestehen häufig aus Untereinheiten, die über nicht kovalente Wechselwirkungen verbunden sind. Von FREITAS et al. [29] wurde die Untereinheitenstruktur der Hauptspeicherproteine verschiedener Leguminosensamen, wie z. B. Lupine, Soja, Erbse, Ackerbohne, Buschbohne, Linse mittels Gelelektrophorese verglichen. Die Untereinheiten der 7 S-Globuline (Viciline) aus Polypeptiden mit Molekularmassen um 5 und 7 kda enthalten kein Cystein und bilden über nichtkovalente Wechselwirkungen eine Quartärstruktur. Sie liegen häufig zu Trimeren mit Molekularmassen zwischen 15 und 21 kda assoziiert vor und enthalten keine Disulfidbrücken [25, 3, 36]. Die 11 S-Globuline (Legumine) bestehen aus einer begrenzten Anzahl von Polypeptiden. Man unterscheidet eine Gruppe leichterer basischer Polypeptide mit 2-25 kda und eine mit schwereren sauren Polypeptiden (35-5 kda). Im Unterschied zu den Vicilinen enthalten die Untereinheiten der 11 S-Globuline in der Regel mindestens eine Disulfidbrücke (s. Kap ).

11 Theoretische Grundlagen S-Globuline Legumine (11 S-Globuline) und Viciline (7 S-Globuline) sind die Hauptspeicherproteine in Leguminosen ihre Anteile variieren jedoch in Abhängigkeit vom Genotyp stark. In der Ackerbohne ist das Legumin zu deutlich größeren Anteilen als Vicilin vorhanden [31, 47]. Da allen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit ein 11 S-Globulin als Ausgangsmaterial zugrunde liegt, wird nur auf diese Globulinspezies näher eingegangen. Die 11 S-Globuline sind aus sechs Untereinheiten zusammengesetzt, die eine geordnete Raumstruktur bilden. Die 11 S-Globuline sind dissoziierende und assoziierende Proteine [32]. Jede Untereinheit besteht aus zwei Polypeptidketten: der sauren &alpha-kette und der basischen &beta-kette, die über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft sind [49]. Die Sekundärstruktur einiger 11 S-Globuline wurde von ZIRWER et al. [33] mittels CD- Spektroskopie untersucht und nach der Methode von PROVENCHER & GLÖCKNER [34] ausgewertet. Demnach weisen sie 4-5 % &beta-faltblattstrukuren und nur ungefähr 1 % helikale Strukturen auf und gehören somit zur Klasse der &beta-proteine. Die Aminosäuresequenzen der 11 S-Globuline verschiedener Leguminosen-Samen (z. B. Pisum sativum L., Vicia faba L. und Lens culinaris L.), ebenso die der 7 S-Globuline, sind sich jeweils ähnlich [35, 31]. Ihre Homologie ist besonders im N-Terminus ausgeprägt [51]. Nachfolgend sind einige Eigenschaften ausgewählt, welche die Homologie der 11 S- Globuline unterstreichen. Die 11 S-Globuline haben Molmassen zwischen 3 und 36 g/mol und Moleküldurchmesser zwischen 1 und 18 nm [36, 37]. Die Sedimentationskoeffizienten S 2,W schwanken zwischen 11 S und 13 S, ihre Diffusionskoeffizienten D 2,w werden mit 3,26-3,83 x 1-7 cm 2 s -1 angegeben [36, 37]. Die Stokesschen Radien der 11 S-Globuline aus Ackerbohne, Erbse und Sonnenblume betragen 5,5-6,45 nm [36]. Die 11 S-Globuline denaturieren (in Abhängigkeit vom Lösungsmittel) bei Temperaturen zwischen 85 und 95 C [38, 39, 149]. Auf diesen Kenntnissen basierend entwickelten PLIETZ et al. [4, 49, 51] für die Quartärstruktur des 11 S-Globulins folgendes Modell (Abbildung 1). Jeweils sechs Untereinheiten (aus &alpha- und &beta-kette bestehend) bilden ein trigonales Antiprisma. Die konservativen N-terminalen Sequenzbereiche von &alpha- und &beta-kette (N &alpha und N &beta ) bilden strukturbestimmende Domänen im Inneren der Untereinheit. Der hydrophile C-terminale Bereich der &alpha- Kette (C &alpha ) liegt an der Oberfläche. Die C-terminalen Bereiche der &beta-ketten (C &beta ) befinden sich im Zentrum des trigonalen Antiprismas und stabilisieren es durch hydrophobe Wechselwirkungen.

12 Theoretische Grundlagen 1 Abbildung 1: Modell des hexameren Moleküls der 11 S-Globuline nach PLIETZ et al. [4, 51] Die Ackerbohne und ihr Hauptspeicherprotein (Legumin) Ackerbohnen gehören zu den ältesten Kulturpflanzen [41]. Archäologische Hinweise führten zu der Einschätzung, daß sie bereits 4-3 v. u. Z. in der Landwirtschaft angebaut wurde [42]. Die Ackerbohne (Vicia faba L.) gehört zur Klasse der Dikotyledonen (Zweikeimblättrige) und der Ordnung Fabales (Leguminosen). Die Ordnung Fabales hat nur einkeimblättrige Früchte, die sich zu den charakteristischen Hülsenfrüchten entwickeln. Ackerbohnen werden neben Erbsen, Linsen, Lupine der Familie Fabaceae (Schme t- terlingsblütler) und der Gattung Vicieae (Wicken) zugeordnet. Durch die Möglichkeit der Luftstickstoffbindung mit Hilfe symbiotischer Knöllchenbakterien in Wurzelknöllchen sind einige Vertreter der Fabaceae auch auf stickstoffarmen Böden wichtige Eiweißlieferanten [43]. Reife Ackerbohnen-Samen enthalten % Kohlenhydrate, 2-31 % Proteine, 1-15 % Wasser und ca. 2 % Lipide [44]. Das Mehl geschälter Ackerbohnen besteht zu ungefähr 31 % der Trockenmasse aus Proteinen [45]. Die Globulinfraktion besteht aus vier Proteinkomponenten mit den Sedimentationskoeffizienten 2 S, 7 S, 11 S und 15 S [46]. Ihre Mengenanteile variieren in Abhängigkeit von der Sorte, aber Legumin und Vic i- lin sind die Hauptkomponenten [44]. Die Globulinfraktion der Ackerbohnen besteht zu etwa 7 % aus Legumin und zu etwa 3 % aus Vicilin [47]. Die Quartärstruktur des Ackerbohnen-Legumins kann mit dem Modell nach PLIETZ et al. [4, 49, 51] (s. Kap ) beschrieben werden. Die Angaben über die Molmasse des hexameren Gesamtmoleküls schwanken in einem Bereich von 35 ± 3 g/mol [48, 49, 5]. Für die schwerere saure Polypeptidkette wurden g/mol und für die basische &beta-kette etwa 2 g/mol ermittelt [48, 51, 52]. Das ellipsoide Molekül

13 Theoretische Grundlagen 11 mit Dimensionen von 12,6 x 12,6 x 8,8 nm besteht aus sechs polymorphen Untereinheiten (&alpha&beta-monomere) mit Molmassen von etwa je 6 g/mol. Man unterscheidet zwei homologe Untereinheitentypen mit ca. 5 %iger Sequenzidentität. Der sogenannte Typ A enthält Methionin, die Untereinheit vom Typ B dagegen ist methioninfrei [53, 54, 56]. Beide Untereinheiten-Typen bilden zu etwa gleichen Teilen die Quartärstruktur des Vicia faba-legumins [54, 55]. Die erste vollständige Sequenz für ein eine Untereinheit codierendes Gen (LeB4) wurde von BÄUMLEIN et al. [56] veröffentlicht. Dabei handelt es sich um eine Untereinheit des B-Typs. Die entsprechende saure, sehr hydrophile &alpha-kette besteht aus 281 Aminosäuren und weist als N-terminale Aminosäure Threonin auf. Die basische, mäßig hydrophobe &beta- Kette aus 181 Aminosäuren enthält Glycin als N-Terminus. Sie sind über eine Disulfidbrücke zwischen der Aminosäure Cys87 der &alpha-kette und Aminosäure Cys7 der &beta-kette miteinander verknüpft. Die Aminosäurezusammensetzung zeigt einen für pflanzliche Globuline charakteristischen hohen Arginingehalt. Desweiteren sind viel Asparagin- und Glutaminsäure enthalten, die zu etwa 5 % amidiert vorliegen. Die Glutaminsäurereste sind besonders in der sauren Polypeptidkette konzentriert, die außerdem deutlich geringere Gehalte an Alanin-, Valin- und Leucinresten als die basische &beta-kette aufweist [57]. Später wurde von SCHLESIER et al. [128] ein, eine Typ A-Untereinheit des Ackerbohnen- Legumins codierendes Gen sequenziert. Die &alpha-kette der Untereinheit von Typ A besteht aus 294 Aminosäuren mit Leucin als N-Terminus, die &beta-kette aus 189 Aminosäuren mit - genau wie bei Typ B - Glycin als N-terminale Aminosäure. Das Molekül besitzt eine Disulfidbrücke zwischen den Aminosäuren Cys86 der &alpha- und Cys7 der &beta-kette. Das aus Untereinheiten zusammengesetzte Ackerbohnen-Leguminmolekül kann dissoziieren und assoziieren. Von SCHWENKE [32] wurde anhand von Literaturdaten verschiedener Samenglobuline das folgende allgemeine Dissoziationsschema der 11 S-Globuline aufgestellt: 11 S 2 x 7 S 6 x 3 S 12 x 2 S (3-36) (2 x 15-18) (6 x 5-6) (12 x 25-3) kda Neben Dissoziation und Aggregation durch Hitzeeinwirkung und alkali- bzw. säureinduzierter Dissoziation ist die Ionenstärke des Lösungsmittels für das Dissoziations- und Assoziationsverhalten von immenser Bedeutung. Damit die Untereinheiten in ihre disulfidverbrückten konstituierenden Ketten dissoziieren, sind reduzierende Bedingungen und Detergentien wie SDS oder andere denaturierende Agentien notwendig.

14 Theoretische Grundlagen Proteinmodifizierung Proteine und Proteinisolate können modifiziert werden, um sie mit wünschenswerten funktionellen und ernährungsphysiologischen Eigenschaften für Nahrungszwecke oder im Non-Food -Bereich zu versehen [6, 58, 59, 6, 61, 62]. Die gezielte Modifizierung von Proteinen wird auch als Werkzeug für die Ableitung allgemeiner Struktur-Funktion- Beziehungen eingesetzt [58, 59]. Um neue Anwendungsmöglichkeiten von Pflanzenproteinen zu finden, werden immer wieder neue Methoden und Verfahren entwickelt. So werden die pflanzlichen Speicherproteine chemisch und enzymatisch, physikalisch oder gentechnisch modifiziert, um ihre physikochemischen Eigenschaften und ihre Funktionalität gezielt zu verändern. Die chemische Modifizierung schließt die Derivatisierung der Aminosäure-Seitenketten von Proteinen und die Hydrolyse von Peptidbindungen ein. Die typischen chemischen Reaktionen werden oft entsprechend dem zu benutzenden Reagenstyp klassifiziert und sind in etlichen Übersichtsarbeiten zusammengestellt worden [59-62]. Die klassische chemische Modifizierung (nicht enzymatische) ist in der Regel einfach und preiswert auszuführen [63]. Viele der chemischen Modifizierungsmethoden sind jedoch für die Anwendung im Nahrungsmittelbereich nicht geeignet [58]. Für die Derivatisierung sind verschiedene reaktive Aminosäure-Seitenketten verfügbar, z. B. Amino-, Carboxyl-, Sulfhydryl- und Phenolgruppen. Die chemische Modifizierung richtet sich im allgemeinen gezielt auf einen bestimmten Seitenketten-Typ sie verläuft aber häufig nicht spezifisch sondern kann mehrere funktionelle Gruppen betreffen [59]. Im Gegensatz zur chemischen ist die enzymatische Modifizierung in der Regel von hoher Spezifität und kann oftmals unter milderen Bedingungen erfolgen. Von besonderer Bedeutung auf enzymatischem Gebiet sind die Hydrolyse der Peptidbindung durch Proteasen, Addition bzw. Entfernung von Substituenten an bzw. aus reaktiven Gruppen der Seitenketten von Aminosäureresten (Phosphatase/Phosphorylase-Kinase, Glycosyl-Transferase, Transamidase) und die Vernetzung (Transglutaminase). Chemische und enzymatische Modifizierung bewirken mit unterschiedlichen Mechanismen ähnliche Veränderungen in der Chemie von Proteinen (Phosphorylierung, Desamidierung, Vernetzung). Die physikalische Modifizierung beruht vor allem auf Hochdruck- und Temperatureinwirkung. Die Hitzedenaturation globulärer Proteine kann zur Aggregation führen, die Proteine werden unlöslich. Die Stabilität der nativen Proteinkonformation gegenüber entfaltenden Prozessen kann durch die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Cysteinresten der Peptidkette erhöht werden. Je niedriger die Temperatur ist, bei der die Entfaltung stattfindet, um so geringer ist die Wahrscheinlichkeit, daß irreversible Reaktionen, wie

15 Theoretische Grundlagen 13 das Aufbrechen von Disulfidbrücken, auftreten. Diese Art der physikalischen Modifizierung ist z. B. für die zunehmende Anwendung von Proteinen als Adhesiva, Überzüge und Filme von Bedeutung [6, 64]. Druckeinwirkung führt zur vollständigen Entfaltung oder zur partiellen Entfaltung der Proteine, die in verdünnten Lösungen oftmals reversibel ist. Da die Proteine bei diesem Prozeß oft eine andere als die native Konformation einnehmen, kann auch auf diesem Wege die Funktionalität modifiziert werden. In der Biotechnologie angewendete gentechnische Verfahren zur Modifizierung basieren auf Mutation. Eine kodierende Gensequenz wird kloniert und in einem geeigneten System zur Expression gebracht, um genügend mutiertes Protein zu erzeugen. In der Hauptsache werden ortsgerichtete oder gezielte Mutation (site-directed) und zufällige Mutation (random) unterschieden. Den Samenproteinen der Leguminosen mangelt es an Methionin und Cystein. Von den verschiedenen Strategien, die erarbeitet wurden, um die limitierte Aminosäurezusammensetzung der Leguminosen-Samenproteine aufzuwerten, kann die Modifizierung der die Proteine kodierenden Gene die ideale Lösung sein [65]. Ein Beispiel dafür ist die Einführung heterologer Sequenzen von Brasilnuß und Sonnenblumensamen- Albuminen, die besonders viel schwefelhaltige Aminosäuren enthalten, in Legumin- und Vicilin-Gene [31, 66]. Die Möglichkeiten zur Verbesserung der funktionellen und ernährungsphysiologischen Eigenschaften auf der Grundlage gentechnischer Methoden am Beispiel der Sojabohne wurden von UTSUMI & KITO [67] zusammengestellt und mit chemischer und physikalischer Modifizierung verglichen. Verschiedene Methoden der chemischen Modifizierung ermöglichen eine zielgerichtete Verbesserung der funktionellen Eigenschaften von Proteinen durch die Veränderung der Oberflächenladung und der nativen Konformation ohne Spaltung der Primärstruktur [68]. Die chemischen Modifizierungsmethoden beruhen auf der Modifizierung der Aminogruppen (Acylierung, Alkylierung) und Carboxylgruppen (Veresterung, Amidierung), der kovalenten Bindung von Aminosäuren, Phosphaten und Kohlenhydraten sowie der Oxidation/Reduktion von Sulfhydrylgruppen/Disulfidbrücken [58]. Die wichtigsten Strategien der chemischen Modifizierung werden in Kapitel bis kurz beschrieben Chemische Modifizierung der Aminogruppen Die Acylierung Die Acylierung (Acetylierung, Succinylierung, Maleinylierung, Citraconylierung) ist eine häufig angewendete Methode zur chemischen Modifizierung von Proteinen (s. z. B. [12, 69]). Als acylierende Reagenzien werden Säureanhydride wie Essigsäure-, Bernsteinsäure-, Maleinsäure- und Citraconsäureanhydrid eingesetzt. Sie können prinzipiell mit allen

16 Theoretische Grundlagen 14 nucleophilen Gruppen reagieren [59], d. h. mit Aminogruppen (N-terminale &alpha- und &epsilon- Aminogruppen der Lysine), phenolischen (Tyrosin) und aliphatischen (Serin, Threonin) Hydroxylgruppen, Sulfhydryl- (Cystein) und Imidazolgruppen der Histidinreste (s. Kap , Abbildung 2). Die entsprechenden Acylderivate sind jedoch von sehr unterschiedlicher Stabilität. Im Gegensatz zum Essigsäureanhydrid, dessen Anwendung die Einführung neutraler Acetylgruppen zur Folge hat, führt die Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid anionische Succinylgruppen an den &alpha- und &epsilon-aminogruppen sowie den Hydroxylgruppen ein (s. Kap , Abbildung 3). Die Nettoladung des Proteins wird negativer. Das führt zu Konformationsänderungen, und diese bedingen z. B. die Erhöhung der Löslichkeit [59]. Maleinsäureanhydrid reagiert mit Proteinen ähnlich wie Bernsteinsäureanhydrid, führt aber zu Hydrolyse-labilen Produkten [59, 7] und wird daher für die reversible Modifizierung der Aminogruppen genutzt [71]. Die bei der Citraconylierung entstehenden Produkte sind noch labiler als die maleinylierten Derivate [72] Acetylierung von Ackerbohnen-Legumin Bei der Acetylierung des Legumins sind Reaktionen an den N-terminalen Aminogruppen und den &epsilon-aminogruppen der Lysinreste sowie an den Hydroxylgruppen der Tyrosin-, Serin- und Threoninreste entsprechend Abbildung 2 zu erwarten [59]. (1) Protein NH 2 + O C O C O CH 3 CH 3 ph >7 O Protein NH C CH 3 + CH 3 COO - + H + (2) Protein OH + O C O C O CH 3 CH 3 ph >7 O Protein O C CH 3 + CH 3 COO - + H + Abbildung 2: Acetylierung von Aminogruppen (1) und Hydroxylgruppen (2) in Proteinen Die Acylierung von Histidin- und Cysteinresten führt in der Regel zu instabilen N- bzw. S-Acylderivaten [59] und wurde daher in der vorliegenden Arbeit nicht berücksichtigt. Die nucleophile &epsilon-aminogruppe des Lysins läßt sich aufgrund ihres pk-wertes und der (zumindest überwiegend) exponierten Lage an der Moleküloberfläche besonders leicht acylieren. In wäßriger Lösung ist bei einem ph zwischen 7 und 8 mit Essigsäureanhydrid

17 Theoretische Grundlagen 15 eine nahezu vollständige Blockierung der &epsilon-aminogruppen des Lysins im Proteinisolat aus Ackerbohnen möglich [73]. Mit zunehmendem N-Acetylierungsgrad nimmt der Anteil der Blockierung positiv geladener &epsilon-aminogruppen durch neutrale Acetylgruppen zu und damit die potentielle positive Ladung der Proteine ab. Die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen benachbarten kationischen Aminogruppen und anionischen Carboxylgruppen werden verringert. Der Anstieg der negativen Nettoladung führt zur Auffaltung der Proteinstruktur und zu Dissoziationsprozessen. Die funktionellen Eigenschaften derart modifizierter Ackerbohnen- Proteine sind erwartungsgemäß verändert [44]. Umfangreiche Untersuchungen an acetyliertem Legumin in Form von Ackerbohnen- Proteinisolaten mit einem Legumin-Anteil von etwa 65 % erfolgten von SCHWENKE et al. [z. B. 19, 2]. Demnach erfolgt die Acetylierung dieses Isolates vorrangig an den &epsilon-aminogruppen des Lysins. Bis etwa 4 % N-Acetylierung werden nur weniger als 5 % der Hydroxylgruppen modifiziert, ab 6 % wird der Anteil der veresterten Hydroxylgruppen signifikant. Der O-Acetylierungsgrad übersteigt jedoch auch bei hoher (89 %) N-Acetylierung nicht 28 %. Mittels nativer Gelelektrophorese wurde festgestellt, daß im Isolat das Legumin als Hauptbande erscheint, die bis 8 % N-Acetylierung erhalten bleibt und erst bei erschöpfend acetylierten Isolaten verschwindet. Ab 6 % Acetylierung der Aminogruppen erscheinen sowohl langsamer laufende Aggregationsprodukte als auch eine schmale Bande aus schneller laufenden Dissoziationsprodukten, die mit zunehme n- der Modifizierung zur Hauptbande werden. Mittels analytischer Ultrazentrifugation wurde mit steigender Acetylierung der Isolate ebenfalls eine deutliche Abnahme des Leguminanteils sowie auch der höhermolekularen 15 S-Aggregate zugunsten des 2 S- Dissoziationsproduktes gefunden. Die Oberflächenhydrophobizität veränderte sich bis zu einem N-Acetylierungsgrad von 6 % nur geringfügig, bei fortschreitender Modifizierung jedoch drastisch. Von SCHMANDKE [44] sind die Auswirkungen der Acetylierung auf die funktionellen Eigenschaften, z. B. die Emulgieraktivität, von Ackerbohnen-Proteinisolaten zusammengefaßt worden. Die Acetylierung der Proteinisolate führt zu verbesserter Emulsionsstabilisierung und zur Ausbildung eines festen Grenzflächenfilmes, der als mechanische Barriere die Destabilisierung von Emulsionen verhindert [74]. Der Einfluß der Legumin-Acetylierung auf die Adsorptionskinetik, Filmdruckverhalten und Emulsionseigenschaften in n-decan/wasser-emulsionen ist von KRAUSE [75] untersucht worden. Dabei wurde anhand von SE-HPLC-Untersuchungen gezeigt, daß hochacetyliertes Ackerbohnen-Legumin zur Aggregation neigt.

18 Theoretische Grundlagen Succinylierung von Ackerbohnen-Legumin Die Succinylierung ist prinzipiell an allen nucleophilen Gruppen der Aminosäurereste möglich [59, 76]. Ebenso wie bei der Acetylierung sind bei der Succinylierung des Legumins Reaktionen an den N-terminalen Aminogruppen und den &epsilon-aminogruppen der Lysinreste sowie an den Hydroxylgruppen der Tyrosin-, Serin- und Threoninreste zu erwarten (Abbildung 3) [59]. Im Falle der Succinylierung von Tyrosinresten muß jedoch der Instabilität der O-Succinylreste aufgrund spontaner intramolekular katalysierter Hydrolyse bei ph > 5 [59] Beachtung geschenkt werden. (1) Protein NH 2 + O C O C O CH 2 CH 2 ph >7 O Protein NH C O CH 2 CH 2 C O - + H + (2) Protein OH + O C O C O CH 2 CH 2 ph >7 O Protein O C O CH 2 CH 2 C O - + H + O (3) C Protein O CH 2 ph > 5 Protein OH O - CH 2 C OOC CH 2 CH 2 COO + H + O Abbildung 3: Succinylierung von Amino- (1) und Hydroxylgruppen (2) sowie Desuccinylierung von O-Succinyltyrosin (3) in Proteinen Die Succinylierung eines Proteins bewirkt die Erhöhung der negativen Nettoladung des Moleküls, was grundsätzlich die verstärkte Neigung zum Zerfall des Proteins in seine Untereinheiten und Entfaltung der Polypeptidketten bedingt [12, 32]. Vielfältige Untersuchungen zur Auswirkung der Succinylierung auf die Chemie und die Funktionalität von Ackerbohnen-Proteinisolaten sind vorgenommen worden [z. B. 77, 78]. Demnach werden bei ph 8 mit einem etwa vierfachen molaren Überschuß an Bernsteinsäureanhydrid maximal 93 % der Aminogruppen durch Succinylgruppen blockiert. Wie bei der Acetylierung erfolgt auch durch Succinylierung die Dissoziation der

19 Theoretische Grundlagen 17 Globuline. Es wird beschrieben, daß die Ackerbohnen-Proteinisolate bei 93 % N- Succinylierung in vollständig, in ihre Untereinheiten mit Sedimentationskoeffizienten von S 2,W = 2,8, dissoziierter Form vorliegen. Die Dissoziation des hexameren Moleküls in seine 5-6 kda schweren Untereinheiten erfolgt über das 7 S-Halbmolekül [79]. Die Succinylierung der Ackerbohnen-Proteinisolate führt aufgrund weitgehender strukt u- reller Veränderungen zu wesentlichen Änderungen der funktionellen Eigenschaften, wie z. B. zur Verbesserung der Gelbildungseigenschaften, der Emulgiereigenschaften bei ph 7 und der Erhöhung der Schaumbildungskapazität ohne Hitzebehandlung [78, 8]. Der Einfluß der Succinylierung auf Ackerbohnen-Legumin ist ebenfalls hinsichtlich der Bildung von Grenzflächenfilmen untersucht worden [81] Die Guanidinierung Stabile Proteine können bei ph > 9,5 mit S-Methylisoharnstoff oder dem stärker reaktiven O-Methylisoharnstoff behandelt werden, um die &epsilon-aminogruppen durch die sehr basischen Guanidinogruppen zu ersetzen [59]. Die Guanidinierung von über 7 % der Lysingruppen des Rinderserumalbumins führte jedoch nur zu geringen Änderungen der Hydrophobizität, der Schaum-, Emulsions- und Geleigenschaften [58] Amidinierung und Alkylierung Unter leicht alkalischen Bedingungen reagieren Imidoester mit Aminen zu Amidinen (Amidinierung). Sowohl &alpha- als auch &epsilon-aminogruppen werden modifiziert [59]. Die Amidinierung bewirkt keine starke Änderung der physikochemischen Eigenschaften von Proteinen. Nach extremer Amidinierung von RSA konnten jedoch veränderte spektroskopische und elektrophoretische Eigenschaften sowie eine Änderung der optischen Rotation beobachtet werden [82]. Die Alkylierung der Aminogruppen kann z. B. durch Maleimide, Acrylonitrile oder Ethylenimine erzielt werden, obgleich die Reaktion im allgemeinen nur als Nebenreaktion bei der Sulfhydrylgruppen-Modifizierung betrachtet wird [59] Chemische Modifizierung der Carboxylgruppen Die Acylierung ist zwar die am genausten untersuchte Methode der chemischen Modifizierung von Nahrungsproteinen - der Nährwert acylierter Proteine ist im Vergleich zum nativen Protein, einzelnen Studien zufolge (z. B. [83]), jedoch gemindert. Die Modifizierung der &beta- und &gamma-carboxylgruppen der nicht essentiellen sauren Aminosäuren (Asparagin- und

20 Theoretische Grundlagen 18 Glutaminsäure) stellt daher eine Alternative zur Acylierung dar. Sowohl die Veresterung als auch die Amidierung der Carboxylgruppen führen zur Erhöhung der positiven Nettoladung des Proteins Die Veresterung Die Carboxylgruppen der Proteine können durch die Behandlung mit Methanol oder Ethanol unter Säurekatalyse verestert werden. Protein-COO - + ROH,2-,1 M HCl Protein-COOR + H 2 O Aus der Blockierung der negativ geladenen Carboxylgruppen resultiert die Zunahme der positiven Nettoladung und die Erhöhung des isoelektrischen Punktes (IP). Die Veresterung von Proteinen führt zu Konformationsänderungen, die sich in der Änderung ihrer funktionellen Eigenschaften widerspiegelt [84] Amidierung Carboxylgruppen von Aspartat und Glutamat können durch die Reaktion mit nucleophilen Reagenzien (z. B. Aminen) und wasserlöslichem Carbodiimid in Asparagin und Glutamin umgewandelt werden [85]. Die Amidierung erfordert relativ milde wäßrige Bedingungen. Protein-COO - + NH 4 + H + Protein-CONH 2 R-N=C=N-R Reduktion bzw. Oxidation von Disulfid- bzw. Sulfhydrylgruppen Disulfid-Bindungen werden durch milde Reduktionsmittel zu Sulfhydrylgruppen reduziert. Für analytische Zwecke werden Thiole mit niedriger Molmasse wie &beta-mercaptoethanol und Dithioerythritol eingesetzt. Die Reaktion ist spezifisch und in Abhängigkeit von Denaturans, ph und Proteinstruktur vollständig. Die Reoxidation der entstandenen Sulfhydrylgruppen kann durch die Alkylierung mit Iodoacetamid oder Acrylnitril verhindert werden [86]. Im Lebensmittel-Sektor werden Sulfit-Ionen, Wasserstoffperoxid und Ascorbinsäure als Reagenzien zur Verbesserung der funktionellen Eigenschaften eingesetzt. So führt der Einsatz von Ascorbinsäure z. B. zur Verringerung der Oberflächenspannung von Proteinen [87]. Die Zugabe von Ascorbinsäure verbessert Teigbildung, Laibvolumen und Krume n- struktur durch Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen. Der Einsatz von Ascorbinsäure zeigt

21 Theoretische Grundlagen 19 positive Effekte auf die Schaum- und Geleigenschaften verschiedener globulärer Proteine [88] Hydrolyse und Desamidierung Der Einsatz von Säuren oder alkalischen Reagenzien dient häufig der Erhöhung der Löslichkeit oder der Verringerung der Viskosität von Proteinen. Die saure oder basische Hydrolyse der Peptidbindungen führt zu Produkten niedrigerer Molmasse mit erhöhter Anzahl ionisierbarer Gruppen und erhöhter Löslichkeit. Die Hydrolyse kann in Abhängigkeit von den Produktanforderungen gut gesteuert werden. So dient die milde Hydrolyse der Herstellung höhermolekularer Abbauprodukte mit erhöhter Funktionalität. Bei der milden sauren Hydrolyse wird die Peptidbindung an der Seite von Asparaginsäureresten 1fach schneller gespalten als andere Peptidbindungen [89]. Die saure Hydrolyse unter milden Bedingungen wird von (nicht-enzymatischer) Desamidierung begleitet. Die Desamidierung von Glutamin- und Asparaginsäureresten ist besonders im Falle der pflanzlichen Speicherproteine von Bedeutung, weil diese sehr hohe Anteile an amidierten Glutaminsäure- und Asparaginsäureresten haben. Das Freiwerden von Carboxylgruppen infolge der Modifizierung bedingt die Zunahme der negativen Nettoladung und der Hydratation des Proteins. Die Desamidierung von Asparagin findet schneller statt als die von Glutamin. Sie folgt bei der sauren Hydrolyse von Asparagin zu Asparaginsäure einem einstufigen (two-state) Mechanismus. Die Desamidierung von Soja-Proteinen führt zu verbesserter Löslichkeit, Wasserbindung, Schaumvolumen, Emulgiervermögen und Viskosität [9]. Desamidierung und Hydrolyse von Peptidbindungen durch Alkali-Behandlung erfolgen schneller als die saure Hydrolyse. Der Einsatz von Basen erfolgt zur Isolierung von Pflanzenproteinen unter Ausschluß toxischer Faktoren [91], zur Produktion von Soja-Proteinen als Fleischäquivalent und bei der Herstellung von Gelatine aus Collagen. Stark alkalische Behandlung von Proteinen kann zur Zerstörung von Lysin, Cystin und Serin und zur Bildung unverdaulicher Produkte führen. Die alkalische Hydrolyse von Asparagin zu Asparaginsäure führt zunächst zu einem cyclischen intramolekularen Imid als Zwischenprodukt. Das Imid kann dann entweder zu einem Asparaginsäurerest hydrolysiert werden oder aber mit einer Aminogruppe unter Ausbildung eines Isopeptids reagieren. Bei hohem ph- Wert und hoher Temperatur kann z. B. aus &beta-substituiertem Cystin Dehydroalanin entstehen, welches mit Lysin zu Lysinoalanin reagiert, was wiederum einen Verlust an essentiellen Aminosäuren bedeutet.

22 Theoretische Grundlagen Die Glycosylierung Proteine können durch die kovalente Bindung von Kohlenhydratresten unterschiedlicher Größe modifiziert werden. Die Glycosylierung erfolgt primär an den Aminogruppen (s. Reaktion 1), teilweise aber auch an den Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen. Die Glycosylierung kann auch die Carboxylgruppen betreffen, z. B. wenn &beta-lactoglobulin (nach Aktivierung mit Carbodiimid) mit Glucosamin umgesetzt wird (s. Reaktion 2). (1) Protein-H 2 N + Glyco-CHO Protein-N=CH-Glyco NaCNBH 3 Protein-N-CH 2 -Glyco (2) Protein-COO - + R -N=C=N-R ph 4-7 Protein-CO-O-C-NH-R NR + Glucosamin Protein-CO-NH-Glucose + R -NH-CO-NH-R Aus praktischer Sicht ist der einfachste Weg der Glycosylierung die Bindung von Zuckerresten an Proteine über die Maillard-Reaktion [92]. Die Einführung von Mono- oder Oligosacchariden erhöht die Hydrophilie eines Proteins. Glycosyliertes &beta-lactoglobulin weist erhöhte Löslichkeit und Hitzestabilität im Vergleich zum nativen Protein auf [93]. Ebenso lassen sich die Oberflächeneigenschaften von Casein durch erhöhte Flexibilität, zunehmende Entfaltung und stärkere Hydratisierung infolge Glycosylierung verbessern. Durch die Glycosylierung werden bei Reaktion mit neutralen Zuckern das Schaumbildungsvermögen und die Schaumstabilität, im Falle der Modifizierung mit geladenen Kohlenhydraten die Emulsionsstabilität verbessert [94] Die Phosphorylierung Die kovalente Bindung von Phosphatgruppen an Proteine führt zur Erhöhung ihrer negativen Ladung. In Abhängigkeit von der Natur des Proteins werden nur O- (z. B. bei Casein [95]) oder nur N-Phosphat-Esterbindungen (z. B. bei &beta-lactoglobulin [97]) oder beide (z. B. bei der Phosphorylierung von Lysozym [95, 96]) gebildet. Bei der Bildung von C-O-P -Bindungsderivaten reagiert anorganischer Phosphor mit den Hydroxylgruppen von Serin, Threonin, Tyrosin. Bei der Bildung von C-N-P -Bindungsderivaten reagiert der Phosphor mit der Aminogruppe in Lysin, der Imidazolgruppe in Histidin und der Guanidingruppe in Arginin. Die sauerstoffgebundenen Phosphatderivate sind säurestabiler als

23 Theoretische Grundlagen 21 die stickstoffgebundenen phosphorylierten Proteine. Die am häufigsten angewendete Methode der chemischen Phosphorylierung ist die Reaktion mit Phosphoroxychlorid: Protein NH 2 + POCl 3 Protein OH + POCl 3 H 2 O H 2 O Protein-NH-PO(O 2 H) - + 3H + + 3Cl - Protein-O-PO(O 2 H) - + 3H + + 3Cl - Bei dieser Art der chemischen Modifizierung kann es über Phosphatbrücken oder Isopeptid-Bindungen zu Quervernetzungen ( cross-links ) innerhalb der Proteinstruktur kommen, was als Ursache für die verringerte Löslichkeit in Wasser angenommen wird [96]. Die Phosphorylierung erhöht die Viskosität, Wasserabsorption, Gel- und Emulsionsbildung von &beta-lactoglobulin und anderen Proteinen [97]. Phosphorylierte Proteine sind sowohl in vitro als auch in vivo gut verdaulich.